酵母培養物中硝酸鹽與肽轉運蛋白螢光活性蛋白傳感器的設計與功能分析

此protocol描述了用於在酵母細胞中設計和部署用於硝酸鹽和肽轉運蛋白活性的遺傳編碼的螢光活性傳感器的方法。將雙親硝酸鹽轉運體CHL1 / AtNRT1.1 / AtNPF6.3或四種不同的肽轉運蛋白（AtPTR1,2,4和5）從阿拉伯芥融合到具有不同光譜性質的一對螢光蛋白，使我們能夠設計NiTracs（硝酸鹽轉運蛋白活性跟蹤傳感器）和PepTracs（肽轉運蛋白活性跟蹤傳感器），比例式螢光活性傳感器，其監測體外膜質膜轉運體或肽轉運蛋白的活性（Ho et al., 2014）。 NiTrac1傳感器對硝酸鹽的添加具有特異性和可逆性的特性，而PepTracs通過減少供體和受體發射能量變化來對應添加多肽，而受體激發的發射能量保持不變，或螢光團發射率的變化。所有傳感器都適用於比例成像。 NiTrac1傳感器偵測範圍[從μM到mM（Liu and Tsay，2003）]和硝酸鹽轉運動力學的天然硝酸鹽轉運體的相位動力學的相似性的特性，指出NiTrac1在運輸循環期間提供關於結構重排的信息，從而能夠偵測在廣泛的外部硝酸鹽濃度範圍內的轉運蛋白活性。 NiTrac的幾種變體已被設計，它們對硝酸鹽（NiTrac1：CHL1; NiTracT101A：CHL1T101A）的親和力不同。 NiTrac還能識別氯酸鹽。在這裡，我們描述了使用分光螢光計設計，實施和檢測酵母細胞中硝酸鹽受體活性的簡單檢測方法。
何承訓

何承訓*，Wolf B. Frommer (2016) Bio-protocol,