儀器原理與應用

共軛焦顯微鏡原理


共軛焦顯微鏡的基本功能為提升傳統螢光顯微影像之品質。其成像原理乃以雷射光取代傳統螢光顯微鏡之汞燈,經由掃描器(Scanner mirrors)的導引,以點接點(Point by point)依序構面的方式,對螢光樣本進行激發(Exitation)與發散(Emission)訊息的擷取。所得之螢光訊息,利用成像共焦面(Confocal plane)處的一小孔(Pinhole),阻擋非焦面的螢光雜光進入感測器(Detector)中,解決傳統螢光顯微鏡在非焦面雜光干擾下的模糊光蔽,產生螢光澄清化的光學切片效果,提升螢光顯微影像品質。


共軛焦顯微鏡應用

利用共軛焦顯微鏡2D螢光影像的澄清特性,在連續擷取Z軸序列圖檔後,可由軟體投影處理,組成清晰的3D立體影像,有助於螢光樣本立體結構方面的研究。


除了螢光標定樣本的靜態空間分佈研究之外,共軛焦顯微鏡利用其點接點(Point by point)依序構面的成像方式,可進一步發展光刺激(Photo-manipulation)方面的動態生理實驗。其方法係利用掃描器及AOTF光切換裝置,明確指定其成像範圍與光刺激範圍,再經由軟體設定的光刺激曠時攝影流程,拍攝光刺激前後之螢光波長、亮度或分佈位置等變化。可應用的實驗類型包括FRAP (Fluorescence recovery after photo-bleaching)、FLIP (Fluorescence loss in photo-bleaching)、iFRAP (inverse FRAP)、FLAP (Fluorescence localization after photo-bleaching)、Photo-activation、Reversible photo-activation等,可運用做分子動態之分析(Molecular dynamics analysis)。


共軛焦顯微鏡所擷取之澄清螢光影像,可依實驗目的,進行後續(off-line)或即時(on-line)的量測分析,可量測分析的內容包括Area、Threshold area、Intensity、Histogram、Profile、Colocalization、FRAP、FRET等。除了影像成果外,更進一步提供量化分析的數據結果。

 

照片、文字╱沈書甄


超高解析度顯微鏡原理

光學顯微鏡受限於繞射現象的干擾,最高解析度僅達200nm。超高解析度顯微鏡係以改變光線激發模式或應用數學運算方式來得到超越繞射極限的超高解析度影像。目前已發展的技術包括SIM(structure illumination microscopy)、STED(Stimulated Emission Depletion)及PAL-M/ STROM(Photoactivated Localization Microscopy/ Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)等。
本室之超高解析度顯微鏡所運用之技術為SIM。其方法如下圖所示:
將一高度空間頻率(high spatial frequency)之光柵陰影(中圖)投影於細微結構之樣本(如左圖之細微線條)上,使原來無法被光學鏡頭解析的細微訊號,因與光柵陰影相互干擾,產生較粗線條之影像(右圖),此現象稱之為Moire fringes。該影像足以被光學鏡頭解析並由相機擷取,擷取下來之影像,再經由數學公式做反轉運算,即可獲得超越傳統兩倍解析度之原始影像。

超高解析度顯微鏡應用

SIM的樣本製備方法與傳統螢光顯微鏡無異,可應用之螢光物質種類僅受限於機體的雷射光源與螢光濾片配備。本室目前配備405、488、561、642四種波長之雷射,可使用紅、橙、綠、藍等四種螢光染劑或螢光蛋白。
在Z軸影像擷取方面,受限於Grid陰影投影的深度限制,可擷取之Z軸深度約30μm。
在活體影像擷取方面,由於同一畫面需擷取15張影像作運算,因此可應用於慢速移動之動態影像擷取,但較不宜快速動態如vesicle movement等實驗觀察。

層光顯微鏡原理

一般螢光顯微鏡或共軛焦顯微鏡,激發光源是由物鏡方向照射樣本,亦由物鏡接收螢光訊號(Epi-Illumination,下圖A、B)。此種照光角度易產生兩種缺點:(1)Z軸越深照光度衰減越嚴重,無法取得較大型樣本(組織、胚胎……)Z軸深處的清晰影像;(2)尚未被對焦拍攝的Z軸平面亦接受照光而容易Bleaching,對活體樣本也較容易產生光毒性。

層光顯微鏡將激發光源從物鏡的Z軸方向改變為與物鏡垂直的X軸方向照射(Light Sheet Illumination,上圖C),同時將圓錐狀光形改成扁平狀光形。由X軸方向照射,一可避免較大型樣本Z軸越深照度越弱的缺點,二可避免非對焦的Z軸平面遭受Bleach;扁平狀光源使XY平面照光面積均勻擴大,可使用「面感測器」(CCD、CMOS)擷取影像,增加活體影像的時間解析度。 除此之外,整體顯微鏡的光路方位亦可由傳統的「垂直正立式」或「垂直倒立式」,改為「水平橫躺式」(下圖),即物鏡是水平方式放置,而樣本改由垂直方式懸吊垂降至一可承裝培養液或Mounting Medium的容器中。懸吊的樣本可任意旋轉面向物鏡的角度,也可拍攝多重角度再由軟體重組成一無觀測死角的立體影像,有助於大型樣本各角度影像的擷取。

層光顯微鏡應用

本室的層光顯微鏡,應用以較大型樣本為主,如斑馬魚胚胎、果蠅胚胎,組織切塊、細胞團塊、植物組織等在共軛焦顯微鏡拍攝時會遇到Z軸深處訊息不足問題的樣本。拍攝倍率主要為20倍物鏡。樣本可以是活體或是固定的,固定的樣本可做折射率1.45附近的透明化處理。樣本需設法懸吊,小型胚胎或組織團塊可包埋於Agarose中(下圖A、C),大塊組織則可直接勾掛或黏掛(下圖B)。雷射配備含405、445、488、515、561、638,可適用於大部份種類的螢光染劑或蛋白。